了解完TAE和TBE,就知道你的电泳白跑的原因了
发布时间：
2021-11-24
跑了这么多年的电泳，你知道它的原理吗？很多人肯定不知道，因为它太基础了，就是刚进实验室的时候，我也没问琼脂糖凝胶电泳的原理，而师兄也只讲了DNA带负电，会往正极跑；EB嵌入到DNA链中，通过紫外照射就能看见了。其余的就不了解了。
凝胶电泳的原理
DNA分子在常规的电泳缓冲液（高于等电点的pH溶液）中5’磷酸的氢离子因解离而被中和，只剩磷酸根离子，故带负电，因而在电场中向正极移动。又由于琼脂糖凝胶具有分子筛效应，在一定的电场强度下，由于待分离样品中的各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使不同DNA分子产生不同的的迁移速度。因此琼脂糖凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子，如质粒的三种构型。下面来说一下TAE和TBE.
TAE是Tris-乙酸，是使用较广泛的缓冲液。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量，且双链线状DNA在其中的迁移率较其他缓冲液快约10%，DNA片段大于13kb时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，DNA片段回收时用TAE缓冲液进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳发热大，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
应用：大片段核酸分子分离，琼脂糖凝胶电泳DNA的回收，酶切检测，PCR反应。
50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)配置如下
242 g ----------- Tris base
57.1 ml ----------- Acetic acid
100ml ------------ 0.5M EDTA
Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5
TBE
TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀。其对小于1kb的片段分离效果较好，但因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，而且硼酸盐 离子有可能影响后续的酶促反应，因此需要切胶回收的实验一般不推荐TBE电泳。
对于一般的仅做检测的电泳常用此缓冲液，如DNA、质粒、RNA提取后的检测。因为TBE跑出来的胶分辨率会比较高。
常配制成10×的母液，可以放置较长时间而不形成沉淀，使用时稀释至0.5×。
10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA)配置如下
108 g--------------- Tris base
55 g --------------- Boric acid
9.3 g --------------- Na4EDTA
Add ddH2O to 1 liter.
The pH is 8.3 and requires no adjustment.
RNA甲醛变性胶
提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。
5X甲醛凝胶电泳缓冲液
0.1mol/L MOPS(PH7.0)
40mmol/L 乙酸钠
5mmol/L EDTA(ph8.0)
电泳前先将RNA在65℃加热处理5 min，并冰上骤冷，以减少RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭（EB，浓度1.0 mg/mL），而不在胶中加EB，这样电泳后的背景较低。
琼脂糖凝胶电泳,TAE,Tris-乙酸
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