了解TRIS-HCL等缓冲液的使用和制备-快速完成WB实验
发布时间：
2022-09-17
蛋白质的溶解和稳定
做WB时要保证电泳成功，破坏蛋白质之间的聚集作用就先要做。比较理想的情况是：细胞裂解和蛋白的溶解都在电泳样品缓冲液中进行。如果没有办法做到这点，就要在增溶溶液中制备蛋白，该溶液包含除垢剂、变性剂/还原剂，以及兼容电泳的缓冲液。其中裂解缓冲液包含不同的除垢剂，可以帮助破坏细胞并释放蛋白，使它们溶于溶液。但是，不同种类的蛋白质与缓冲液和除垢剂的反应是有所不同的。
花很长时间制备的细胞提取液检测不到目的蛋白，WB实验好不容易做完了结果发现条带很弱或没有条带，这是科科研人的WB现状，道理都懂但却状况百出。假如遇到目标蛋白在溶液中不溶解，或者蛋白-蛋白相互作用比较特殊，则需要尝试使用其他特殊缓冲液，并交换去除除垢剂。那么在进行 WB 时关于缓冲液、还原剂的选择和使用以及有哪些原则可以遵循？
缓冲液使用的一般原则
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蛋白质种类 |
常用的缓冲剂 |
注意事项 |
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全细胞裂解物和膜结合蛋白 |
RIPA 、NP-40 |
RIPA 缓冲液的强力特性适合难溶蛋白 |
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核/线粒体蛋白 |
选 RIPA |
通常先使用分级分离方案来增加特定细胞器及目标蛋白的浓度。 |
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细胞质蛋白 |
Tris-HCl 、RIPA （Tris-HCl 有时优势更大） |
需要根据实验确定条件，以获取更多的目标蛋白。 |
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天然状态蛋白质 |
CHAPS（两性离子除垢剂，能更好保护蛋白的天然状态） |
常用于等电聚焦 （IEF） 和 2-D 电泳。 |
常用裂解缓冲液配方
为帮助大家进行 WB 实验时更好的了解缓冲液的使用原则，这里也给到了一些常用的缓冲液配方以及常用的还原剂种类，裂解缓冲液配方如下所示：
Tris-HCI配方：20mM Tris-HCl, pH7.5
CHAPS配方： 150mM KCI ；50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；0.1%CHAPS（3-3-胆酰胺丙基二甲氨基-丙磺酸内盐）
RIPA配方： 150mM NaCI；1%NP-40 or Triton X-100； 0.5% sodium deoxycholate ； 0.1%SDS； 50mM Tris（pH8.0）
NP-40配方：150mM NaCI；1%NP-40or Triton X-100；50mM Tris（pH8.0）
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