新闻中心

全部分类

首页

肌氨酸氧化酶SOX的纯化

发布时间：

2021-04-16

肌氨酸氧化酶简称SOX，是肌肉代谢产物肌酐的代谢过程中一种重要的酶，生化检测中它被用于检测肌酐的含量，其酶活直接影响检测结果准确性，检测中需采用纯化后的SOX。

肌氨酸氧化酶基因工程制备纯化

肌氨酸氧化酶法测定肌酐：

肌氨酸氧化酶与肌酐酶、肌酸酶CRH耦联催化使肌酐最终降解成为甘氨酸与过氧化氢，以此为基础可以进行肌酐的测定。血液、尿液中肌酐的含量是判断肾功能是否正常的一个重要指标，通常采用肌氨酸氧化酶法测定肌酐：以色原底物TOPS通过Trinder反应测量肌酐经SOX催化后生成的过氧化氢，显色产物的量由吸光度测得，吸光度与肌酐含量成正比。

所用的肌氨酸氧化酶由基因工程制备并进行纯化：

将来源于芽孢杆菌Bacillussp.的肌氨酸氧化酶（SOX)基因克隆并转化至大肠杆菌E.coli表达，经IPTC试剂诱导后，收集E.coli湿菌体后，采用20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）缓冲液（pH8.0)清洗后上离心机离心；
离心完成后，去除上清液，然后重新将菌体悬浮于20mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0)中超声波破碎。破壁条件为4min/1min（超声时间/间歇时间)，破壁时间为20min，至溶液变澄清，即获得肌氨酸氧化酶的粗酶液。
采用琼脂糖sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸亲和层析纯化肌氨酸氧化酶，用20mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0)平衡亲和层析柱，再将粗酶液进样层析柱，采用0.03mo1/L NaC1/ 20mmo1/L Tris-HC1缓冲液(pH8.0)洗脱目的蛋白质。

纯化后的肌氨酸氧化酶经SDS-PAGE分析，在相对分子质量43kDa处有明显单一蛋白质条带。经sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸亲和纯化，粗酶液中杂蛋白质基本除去，纯化的SOX达到电泳纯，比酶活为30.8U/mg，酶活回收率91.2%。采用MALDI-T0F对SOX相对分子质量进行鉴定，该重组蛋白质相对分子质量43.8kDa，与来源Bacillus sp.B-0618的SOX(相对非常质量43839Da），纯化后的样品置于4℃保存备用。